December 4, 2020
lembcke

Calreticulin-eksponering dikterer immunogeniciteten ved kræftcelledød

Calreticulin-eksponering dikterer immunogeniciteten ved kræftcelledød

Anthracyclin-behandlede tumorceller er særligt effektive til fremkaldelse af et anticancerimmunrespons, hvorimod andre DNA-skadelige midler såsom etoposid og mitomycin C ikke inducerer immunogen celledød. Her viser vi, at anthracycliner inducerer hurtig, preapoptotisk translokation af calreticulin (CRT) til celleoverfladen. Blokade eller nedbrydning af CRT undertrykte fagocytose af anthracyclin-behandlede tumorceller af dendritiske celler og afskaffede deres immunogenicitet hos mus.

Den anthracyclin-inducerede CRT-translokation blev efterlignet ved inhibering af proteinphosphatase 1 / GADD34-komplekset. Administration af rekombinant CRT eller inhibitorer af proteinphosphatase 1 / GADD34 gendannede immunogeniciteten af ​​celledød fremkaldt af etoposid og mitomycin C og forstærkede deres antitumoreffekter in vivo. Disse data identificerer CRT som et nøglefunktion, der bestemmer anticancerimmunresponser og afgrænser en mulig strategi for immunogen kemoterapi.

Endotel til mesenchymal overgang bidrager til hjertefibrose

 

Hjertefibrose, associeret med et nedsat omfang af mikrovaskulatur og med afbrydelse af normale myokardiale strukturer, skyldes overdreven aflejring af ekstracellulær matrix, som medieres ved rekruttering af fibroblaster. Kilden til disse fibroblaster er uklar, og specifikke anti-fibrotiske terapier er i øjeblikket ikke tilgængelige.

Her viser vi, at hjertefibrose er forbundet med fremkomsten af ​​fibroblaster, der stammer fra endotelceller, hvilket tyder på en endotel-mesenkymal overgang (EndMT) svarende til begivenheder, der opstår under dannelsen af ​​den atrioventrikulære pude i det embryonale hjerte. Transformerende vækstfaktor-beta1 (TGF-beta1) inducerede endotelceller til at gennemgå EndMT, mens knoglemorfogent protein 7 (BMP-7) bevarede endotelfænotypen.

 

Den systemiske administration af rekombinant human BMP-7 (rhBMP-7) inhiberede signifikant EndMT og progressionen af ​​hjertefibrose i musemodeller af trykoverbelastning og kronisk afstødning af allotransplantat. Vores fund viser, at EndMT bidrager til progressionen af ​​hjertefibrose, og at rhBMP-7 kan bruges til at hæmme EndMT og til at gribe ind i udviklingen af ​​kronisk hjertesygdom forbundet med fibrose.

lembcke
lembcke

Et forbedret forbigående ekspressionssystem i planter baseret på undertrykkelse af gendæmpning af p19-proteinet af tomatbusket stuntvirus

Transient genekspression er en hurtig, fleksibel og reproducerbar tilgang til højniveauekspression af nyttige proteiner. I planter kan rekombinante stammer af Agrobacterium tumefaciens anvendes til forbigående ekspression af gener, der er blevet indsat i T-DNA-regionen i det bakterielle Ti-plasmid. En bakteriekultur vakuuminfiltreres i blade, og efter T-DNA-overførsel er der ektopisk ekspression af genet af interesse i plantecellerne.

Systemets anvendelighed er imidlertid begrænset, fordi ektopisk proteinekspression ophører efter 2-3 dage. Her viser vi, at post-transkriptionel gendæmpning (PTGS) er en væsentlig årsag til denne manglende effektivitet. Vi beskriver et system baseret på co-ekspression af en viral-kodet suppressor af gendæmpning, p19-proteinet af tomatbusket stuntvirus (TBSV), der forhindrer begyndelsen af ​​PTGS i de infiltrerede væv og tillader højt niveau af forbigående ekspression.

Ekspression af en række proteiner blev forbedret 50 gange eller mere i nærværelse af p19, så proteinoprensning kunne opnås fra så lidt som 100 mg infiltreret bladmateriale. Virkningen af ​​p19 var ikke mættet i celler, der havde modtaget op til fire individuelle T-DNA’er og vedvarende indtil bladets ældning.

På grund af sin enkelhed og hurtighed forventer vi, at det p19-forbedrede ekspressionssystem vil have værdi i industriel produktion samt et forskningsværktøj til isolering og biokemisk karakterisering af en bred vifte af proteiner uden behov for den tidskrævende regenerering af stabilt transformerede planter.

Molekylær karakterisering af mitokondrie-apoptose-inducerende problem

Mitokondrier spiller en nøglehalvdel inden for reguleringen af ​​apoptose (celledøning). Deres intermembranhus rummer et antal proteiner, der kan frigøres via den ydre membran for at deltage i nedbrydningsdelen af ​​apoptose. Lige her rapporterer vi identifikation og kloning af et apoptose-inducerende problem, AIF, hvilket er nok til at inducere apoptose af fjernede kerner.

AIF er et flavoprotein med relativ molekylvægt 57.000, som deler homologi med de bakterielle oxidoreduktaser; det er normalt begrænset til mitokondrier, men translokeres til kernen, når apoptose induceres. Rekombinant AIF forårsager kromatinkondensation i fjerntliggende kerner og fragmentering af DNA i stor skala. Det inducerer oprenset mitokondrier til at lancere de apoptogene proteiner cytochrom c og caspase-9.

Mikroinjektion af AIF i cytoplasmaet af intakte celler inducerer kondensation af kromatin, spredning af mitokondrie-transmembranpotentialet og publicitet af phosphatidylserin i plasmamembranen. Ingen af ​​disse resultater forhindres af den omfattende caspaseinhibitor, ofte kendt som Z-VAD.fmk.

Overekspression af Bcl-2, som styrer åbningen af ​​mitochondriale permeabilitetsovergangsporer, forhindrer udledning af AIF fra mitokondrionen har dog ingen indflydelse på dens apoptogene øvelse. Disse resultater påpeger, at AIF er en mitokondrie-effektor af apoptotisk celledød.

 

Sikkerhed og effektivitet af genskift til Lebers medfødte amaurose

Lebers medfødte amaurose (LCA) er en gaggle af arvelige blændende lidelser med debut i hele barndommen. En type sygdom, LCA2, kan tilskrives mutationer i det retinale pigmentepitel-specifikke 65-kDa-proteingen (RPE65). Vi undersøgte beskyttelsen af ​​subretinal forsyning af et rekombinant adeno-associeret virus (AAV), der bærer RPE65 komplementært DNA (cDNA) (mængde ClinicalTrials.gov, NCT00516477 [ClinicalTrials.gov]).

Tre syge med LCA2 havde en passende native og systemisk bivirkningsprofil efter levering af AAV2.hRPE65v2. Hver berørt person havde en beskeden fortryllelse i målinger af nethinden udfører på subjektive vurderinger af synlig skarphed. Hos en enkelt berørt person udviklede sig et asymptomatisk makula-hul, og selv om prævalensen blev anset for at være en modsat begivenhed, havde den berørte person en vis tilbagevenden af ​​nethinden. Selvom opfølgningen var meget kort, og regelmæssig fantasifuld og forudgående ikke blev opnået, giver denne undersøgelse forudsætningen for yderligere genundersøgelsesforskning hos patienter med LCA.

Nye regulatorer for knogledannelse: molekylære kloner og aktiviteter

Proteinekstrakter afledt af knogle kan starte den proces, der begynder med bruskdannelse og ender i de novo knogledannelse. De kritiske komponenter i dette ekstrakt, betegnet knoglemorfogenetisk protein (BMP), der direkte brusk og knogledannelse såvel som de konstitutive elementer, der leveres af dyret under denne proces, har længe været uklare. Aminosyresekvens er afledt af et stærkt oprenset præparat af BMP fra kvægben.

Nu er humane komplementære DNA-kloner svarende til tre polypeptider til stede i dette BMP-præparat blevet isoleret, og ekspression af de rekombinante humane proteiner er opnået. Hver af de tre (BMP-1, BMP-2A og BMP-3) ser ud til at være uafhængigt i stand til at inducere dannelsen af ​​brusk in vivo. To af de kodede proteiner (BMP-2A og BMP-3) er nye medlemmer af TGF-beta-supergenfamilien, mens den tredje, BMP-1, ser ud til at være et nyt reguleringsmolekyle.

 

Konstruktion af alsidige vektorer med lavt antal kopier til kloning, sekventering og genekspression i Escherichia coli

Ved anvendelse af polymerasekædereaktion og standard rekombinant DNA-teknikker er der konstrueret en række nye multifunktionelle lav-kopi-nummer (lcn) vektorer, pWSK29, pWKS30, pWKS129 og pWKS130. Plasmiderne pWSK29 og pWKS30 bærer ampicillin-resistensmarkøren (ApR), 20 unikke kloningssteder flankeret af T7- og T3-RNA-polymerase-promotorer, lacZ-alfa-genet og bakteriofagen f1 replikationsorigin (ori) til produktion af enkeltstrenget (ss) DNA i nærvær af en hjælperfag.

Plasmiderne pWSK129 og pWKS130 bærer kanamycin-resistensmarkøren (KmR) og har 16 unikke kloningssteder flankeret af T7- og T3-RNA-polymerase-promotorer placeret inden i lacZ-alfa-genet. Plasmider pWSK129 og pWKS130 indeholder også f1 ori til generering af ss DNA i nærvær af en hjælperfag. Alle plasmiderne har en lcn på seks til otte pr. Celle. Hver vektor kan bruges til:

(i) komplementeringsanalyse, (ii) generering af envejsdeletioner med exonuclease III / S1-nuklease, (iii) DNA-sekventering, (iv) højniveau-genekspression under anvendelse af T7 RNA-polymerase og (v) afstrømningstranskription. De er meget nyttige til analyse af gener, der koder for proteiner, som er toksiske i Escherichia coli med højt kopiantal.

Gateway-kompatible vektorer til plantefunktionel genomik og proteomik

Gateway-kloningsteknologi letter kloning af målsekvenser med høj gennemstrømning ved at gøre brug af det bakteriofag-lambda-stedsspecifikke rekombinationssystem. Målsekvenser fanges først i en kommercielt tilgængelig “indgangsvektor” og rekombineres derefter til forskellige “destinationsvektorer” til ekspression i forskellige eksperimentelle organismer.

Gateway-teknologi er blevet omfavnet af en række plantelaboratorier, der har konstrueret destinationsvektorer til promotorspecificitetsanalyser, proteinlokaliseringsundersøgelser, protein / protein-interaktionsundersøgelser, konstitutive eller inducerbare proteinekspressionsstudier, gennedbrydning ved RNA-interferens eller affinitetsoprensningsforsøg. Vi gennemgår de forskellige typer Gateway-destinationsvektorer, der i øjeblikket er tilgængelige for planteforskningsfællesskabet og giver links og referencer for at muliggøre yderligere information om disse vektorer.

Vi beskriver også et sæt “pEarleyGate” plasmidvektorer til Agrobacterium-medieret plantetransformation, der translationelt smelter sammen FLAG-, HA-, cMyc-, AcV5- eller tandemaffinitetsoprensningsepitopmærker på målproteiner med eller uden et tilstødende fluorescerende protein.

Oligopeptidepitopmærkerne tillader affinitetsoprensning, immunolokalisering eller immunudfældning af rekombinante proteiner udtrykt in vivo. Vi demonstrerer anvendeligheden af ​​pEarleyGate destinationsvektorer til ekspression af epitopmærkede proteiner, der kan affinitetsfanges eller lokaliseres ved immunfluorescensmikroskopi.

Antistoffer, der detekterer FLAG-, HA-, cMyc- og AcV5-mærkerne viser relativt lille krydsreaktion med endogene proteiner i en række monokotyledone og dikotyledone planter, hvilket antyder bred anvendelighed for mærkerne og vektorerne.

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *